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New Lyme Prueba Cultura Error Analysis CDC

lyme disease test revealed as contaminated using DNA analysis of borrelia

Análisis de ADN revela contaminación bacteriana probable en nuevos resultados de las pruebas de enfermedad de Lyme.

Contaminación de laboratorio se ha destacado como la explicación más probable para la alta incidencia de resultados positivos para La enfermedad de Lyme encontrado por los investigadores en desarrollo un nuevo tipo de prueba para la enfermedad de Lyme. Los investigadores de los EE.UU. Centros para el Control de Enfermedades encontró que casi la totalidad de las muestras de los pacientes utilizados como prueba del éxito de una nueva prueba de cultivo enfermedad de Lyme contenida cepas de bacterias genéticamente similares a los utilizados en el desarrollo de la prueba, lo que sería extremadamente poco probable que ocurra naturalmente.

Una prueba de la enfermedad de Lyme con resultados demasiado bueno para ser verdad?

La prueba de cultivo de la enfermedad de Lyme se está desarrollando Dr.. Eva Sapi y colegas en Connecticut, que publicó un artículo a principios de este año, destacando su éxito. La técnica consistió en tomar muestras de suero de pacientes sabe que son positivos para la bacteria de la enfermedad de Lyme y el uso de cultivo de estas muestras a continuación, se prueba para la presencia de Borrelia. Los cultivos positivos se encontraron en 47% de los casos dentro de los seis días de muestreo, y en 94% de los casos dentro de 16 semana. Un grupo de control de 48 las personas sin enfermedad de Lyme se utilizó en el estudio, comparándolos con un grupo inicial de 50 Pacientes de la enfermedad de Lyme y un segundo grupo de 72 casos confirmados. Las bacterias se identificaron mediante inmunotinción, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y la secuenciación directa de ADN.

Precaución sobre tales resultados positivos

La alta tasa de éxito de esta nueva prueba fue recibida con entusiasmo por muchos defensores de los pacientes con enfermedad de Lyme, pero los científicos que trabajan en el campo de las enfermedades infecciosas recomienda precaución ya que el método era nuevo y sin confirmar. Esta precaución se presentan sabio en retrospectiva como la última evaluación del método sugiere que la alta tasa de seropositividad encontrada puede haber sido debido a la contaminación en el laboratorio.

Coincidencia de ADN de bacteria de la enfermedad de Lyme

En las pruebas de la enfermedad de Lyme con la secuenciación del ADN es común ver una gran variedad de firmas genéticas como Borrelia reproducen y mutan muy rápidamente. La homogeneidad entre los resultados de estas pruebas es poco probable, a menos que los casos de prueba se infectaron deliberadamente en un ambiente controlado usando una sola fuente de bacterias. Lo que los investigadores de los CDC se encuentran en el análisis de los resultados del estudio de Sapi fue que alrededor de 80% de secuencias de muestras de los pacientes eran indistinguibles de los que se utilizan en el desarrollo de la prueba. Sólo 10 de los 51 secuencias pyrG identificados eran diferentes a las cepas bacterianas de los investigadores y los científicos del CDC señalan que, si bien no están seguros acerca de la pertinencia de estas cepas, la validación de cualquier nuevo método de prueba es esencial para evitar el tratamiento innecesario de antibióticos después de un falso positivo para la enfermedad de Lyme.

Nueva prueba detecta la enfermedad de Lyme cepas bacterianas no está presente en EE.UU.

Barbara J.B. Johnson, PhD, de la División de Enfermedades Transmitidas por Vectores en Fort Collins, Colorado, y sus colegas de los CDC estaban particularmente interesados ​​en la elaboración de la razón por la secuenciación del ADN utilizado en este estudio parece indicar que la mayoría de los pacientes estaban infectados con cepas de la bacteria de la enfermedad de Lyme que no habían sido detectadas en pacientes de Estados Unidos o Canadá. Estas cepas, Borrelia afzelii y Borrelia garinii, se encuentran más comúnmente en Europa y Asia, pero no se sabe que está presente en América del Norte.


¿Cómo se ideó la prueba

Los investigadores que desarrollan la prueba utilizaron dos cepas bacterianas de la enfermedad de Lyme comúnmente empleados en las pruebas de laboratorio de la enfermedad en los EE.UU., B31 y 297, junto con las dos cepas de Eurasia. Estas cepas, cuando se encuentran en pacientes con EE.UU., se supone que son el resultado de la exposición a las garrapatas cuando se viaja fuera de los EE.UU., sin detección confirmada de estas bacterias en las garrapatas probados en territorio de EE.UU..

La contaminación bacteriana y los falsos positivos

Como tal, los científicos de los CDC comenzaron a preguntarse si el alto grado de homogeneidad entre las muestras de prueba y la presencia de cepas bacterianas improbables no era un resultado de la exposición y la infección, sino de la contaminación accidental en el laboratorio del propio protocolo de pruebas. Incluso las diferentes cepas de estas bacterias haría, si la infección ha surgido naturalmente, resultado en diferentes secuencias de ADN entre muestras de los pacientes y por lo que los científicos compararon las secuencias para pyrG 51 aislados de pacientes utilizando los mismos cebadores que los utilizados por Sapi, et al.

Partidos casi exacta de Referencias cepas

Lo que encontraron fue la más de la mitad (53%) de las muestras de los pacientes estaban infectados con B. un vapor, con 20 de los 27 encontrado para ser clones idénticos a la cepa utilizada como referencia en el desarrollo de la prueba. Las diferencias en las otras muestras se limitan a un solo nucleótido mutado en cinco casos, dos diferencias en uno de los casos, y tres diferencias en el caso restante. Este tipo de similitudes son muy sugestivos de algo que no sea de origen natural infección.

Menor que 10% de las muestras no muy sospechosas

Además, 41% de los 51 los pacientes tenían B. secuencias burgdorferi relacionados y todos menos uno de ellos tenía coincidencias exactas con la cepa de referencia. Las muestras de los dos pacientes contenían cepas de B. afzelii estrechamente relacionada con la muestra de referencia, lo que significa que 80% (41/51) de las muestras de los pacientes eran idénticas a las cepas de prueba, con otra 12% que difieren en un único nucleótido. Eso deja sólo 4 pacientes cuyas pruebas no eran una coincidencia exacta o un partido casi idéntica a las cepas bacterianas utilizadas en esta novela, y la prueba, aparentemente exitosa.

Además validación necesaria

En lugar caritativamente, los investigadores de los CDC señalan que "se requiere mayor validación del método de cultivo novel propuesta,” a pesar de lo que parece ser una indicación muy clara de que algo haya ido mal con el protocolo de prueba que conduce a la contaminación con las cepas de referencia. La sospecha de contaminación podría ser debido a la utilización de métodos de PCR que se emplea a pesar de tener poco mérito cuando el cultivo contiene suficientes bacterias para ser visto bajo un microscopio. Como las muestras de control no fueron probados utilizando la PCR puede ser que estos evitarse la contaminación, lo que resulta en seronegatividad. Si hubieran sido todos probados por PCR puede ser que Sapi, et al, habría encontrado un sorprendentemente alto porcentaje de positividad para la enfermedad de Lyme, entre los que no tienen otra indicación de la enfermedad. Este, sí mismo, tendría (con suerte) dado la voz de alerta acerca de los protocolos de pruebas.

El ejercicio de optimismo cauteloso sobre nuevos protocolos de pruebas de la enfermedad de Lyme

Sin llevar a cabo el estudio de nuevo, la eliminación de la etapa de la prueba de PCR, es imposible decir si esto fue lo que provocó la sospecha de contaminación y, en efecto, si la nueva prueba podría ser útil para la detección de la enfermedad de Lyme. Lo que la experiencia nos dice es que un solo estudio presenta resultados que parecen demasiado buenas para ser verdad debería conducir a un optimismo prudente y sano escepticismo, en lugar de aumentar las esperanzas listo para ser discontinua.

Referencias

Barbara J.B. Johnson #, Mark A. Pilgard y Theresa M. Russell, Evaluación del Nuevo Método Cultura a las especies DetectBorrelia en el suero de pacientes con enfermedad de Lyme, J Clin Microbiol. Publicado agosto en línea 14, 2013.

Sapi E, Pabbati N, Datar A, Davies EM, A Rattelle, Kuo BA. Mejora de Condiciones de cultivo para el crecimiento y la detección de Borrelia de suero humano. Int J Med Sci 2013; 10(4):362-376. Disponible en http://www.medsci.org/v10p0362.htm


{ 2 comentarios… añadir una }
  • Tom Agosto 29, 2013, 1:00 al

    El CDC ha entrado en sus secuencias pyrG en el NCBI GenBank

    Borrelia burgdorferi 297 CTP sintasa (pyrG) gene, cds parcial, GenBank: KF170281.1, 707 pb
    http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KF170281.1

    Borrelia garinii cepa Fuji P1 CTP sintasa (pyrG) gene, cds parcial, GenBank: KF170282.1, 645 pb
    http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KF170282.1

    Borrelia afzelii cepa BO23 CTP sintasa (pyrG) gene, cds parcial, GenBank: KF170280.1, 687 pb
    http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KF170280.1

    He utilizado la herramienta de comparación de secuencias de ADN Virginia.edu hacer un 1:1 comparar de cada una de las secuencias de los CDC contra cada una de las secuencias de ALS como en la tabla de papel CDC:

    “Tabla: La comparación de las secuencias de genes pyrG paciente asociadas con las de cepas de laboratorio de B. burgdorferi sensu lato.”

    Herramienta Virginia.edu -> http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_w … rm = comparan

    La herramienta de comparación de secuencias Virginia.edu permite a uno entrar en secuencias con los números de acceso de la base de datos NCBI. Da un partido porcentaje de secuencias y programas alineados diferencias,

    Los CDC papel porcentajes de mesa son correctos para las secuencias garinii y azfeli.

    Los CDC de papel de la tabla son en porcentajes de error por un carácter para las secuencias de burgdorferi porque hay un error en la secuencia de los CDC para KF170281.1 en su posición de carácter 618 = “y”. “Y” no es una base válida. Esta es la posición 546 en el 603 secuencia de letras para la ELA Bb JX867374.1 donde es un “C”.

    Aparte de el error CDC en su secuencia, sus porcentajes son correctas si se ignora esta posición carta. El papel de los CDC debe corregirse. Son una 100% coincidir al 602/602, no 603/603. Esto demuestra la dejadez por parte de la CDC, pero no es muy relevante.

    Revisé la garinii aísla para ver si alguno de los errores indicados en el cuadro CDC fueron en la misma posición. Cada error en los aislamientos garinii apareció al azar. Todos ellos aparecieron en posiciones aleatorias y las letras. Me preguntaba si ellos agrupados o fueron al azar. Random sugiere posibles errores en la secuencia, mientras que los grupos puedan implicar una secuencia única que sólo variaba en una letra.

    Así que hay una coincidencia inquietante y partidos cercanos entre los aislamientos ALS y la ATCC proporcionado fotos B. burgdorferi sensu stricto cepa 297 (ATCC 53899), B. afzelii cepa BO23 (11) (ATCC76 51992), y B. garinii cepa Fuji P1 (11) (ATCC 51991).

    Desde garinii no se ha encontrado en pacientes de Estados Unidos ni las garrapatas, excepto las aves marinas, la problemática que 27 de los aislamientos de ELA fueron garinii. Esto implica tanto Borrelia garinii se ha perdido en los EE.UU. por más de 25 años de investigación y estas personas se infectaron fuera de los EE.UU., donde se encuentra garinii.

    Es aún más preocupante que 20 de ellos tienen exactamente el mismo 603 carta pyrG parcial y el otro 7 están muy cerca y aparecen como errores de secuenciación al azar.

    Además, es preocupante que la ATCC adquirió garinii cepa Fuji P1 (ATCC 51991) También tiene la misma secuencia de gen pyrG parcial.

    Cabe señalar que el garinii no también de acuerdo 2 garinii cepas existentes de Japón y Rusia. No Europa.

    Borrelia garinii cepa Ekb704 11-CTP sintasa (pyrG) gene, cds parcial, GenBank: JX971327.1 Rusia
    http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/JX971327

    Borrelia garinii gen pyrG de la CTP sintasa, cds parcial, aislar: HP1, GenBank: AB555778.1 Japón
    http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AB555778.1

    Creo ALS tiene que explicar por qué se encontró una cepa garinii Eurasia en su estudio y por qué todos tan estrechamente coincide y por lo que también coincide muy de cerca la prueba ATCC adquirió garinii cepa Fuji P1 (ATCC 51991).

    Creo que esto va a ser difícil de explicar a menos que todas estas personas viajaron a Eurasia. Incluso entonces se requerirá de estudios de seguimiento para validar realmente la cultura.

    Los resultados de la Borrelia burgdorferi no se cortan lo más clara. Hay una serie de cepas de Estados Unidos que responden a los aislados. El partido de la cepa de prueba es lamentable.

    El resultado azfelii tampoco es tan preocupante. Alguien en el estudio podría haber elegido esto fuera de los EE.UU.. El partido de la cepa de prueba es lamentable.

    El segundo azfelii parece extraño. El azfelii más cercano en la base de datos NCBI es una 584/603 emparejar. Esto es bastante distante y sugiere la secuencia puede haber venido de un error de mezcla de ADN. Su claro en el mejor. Parecería extraño que ninguna cepa azfelii base de datos NCBI existente estaba ni siquiera cerca.

    Lo siento, no contento de informar de que he sido un defensor de la cultura ALS y confió en que se demuestra que es válida. No estoy a favor de IDSA y CDC. Me han cultivado 3 momentos positivos. Yo preferiría aprender la cultura es válida y confirma mi serología positiva y sería útil para confirmar el éxito del tratamiento y al final de mi infección. Esto es por qué las culturas son el estándar de oro. También quiero saber la verdad. Invalidar este estudio la cultura no significa nada más que sólo eso. Esperemos que los estudios de seguimiento muestran la cultura es buena.

  • María Louis Septiembre 4, 2013, 4:58 pm

    CDC son culpables de falsas acusaciones.
    Sin contaminación podría haber ocurrido, que se celebraron las cepas de laboratorio 200 millas del laboratorio en el que los pacientes’ la sangre se cultivó.

    CDC también publicó las secuencias de ADN re afirmaban que habían presentado en el GenBank – estos no estaban allí. Ahora se han presentado (muy tarde) y existen discrepancias con lo que informan.

    B. garinii se encuentra en México por lo que lógicamente estaría en EE.UU. también.

    Increíblemente, Dr McSweegan de NIH pretneded ser un paciente durante años para engañar a la gente haciéndole creer la prueba no es válida. Confesó que en LYmeNet “LHCTom” aka Tom Eames era realmente lo. McSweegan fue destituido de su cargo como Oficial de Programa de Lyme en los NIH hace años por acosar a activistas de pacientes.

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