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New Lyme Cultura Test fallito CDC Analisi

lyme disease test revealed as contaminated using DNA analysis of borrelia

L'analisi del DNA batterico rivela probabile contaminazione nei nuovi risultati della prova della malattia di Lyme.

Contaminazione del laboratorio è stato messo in evidenza come la spiegazione più probabile per l'alta incidenza di risultati positivi per La malattia di Lyme trovato dai ricercatori di sviluppo di un nuovo tipo di test per la malattia di Lyme. I ricercatori del US Centers for Disease Control ha scoperto che quasi tutti i campioni dei pazienti usati come prova del successo di un nuovo test di cultura malattia di Lyme contenuta geneticamente ceppi di batteri simili a quelli utilizzati nello sviluppo del test di, che sarebbe estremamente improbabile naturalmente.

Un test Malattia di Lyme con risultati Troppo bello per essere vero?

La prova di cultura malattia di Lyme è stato sviluppato da Dr. Eva Sapi e colleghi in Connecticut, che ha pubblicato un articolo all'inizio di quest'anno che delinea il loro successo. La tecnica coinvolto prelevare campioni di siero da pazienti noti per essere positivo per batteri malattia di Lyme e coltivando utilizzando questi campioni per poi verificare la presenza di Borrelia. Colture positive sono stati trovati in 47% dei casi entro sei giorni di campionamento, e in 94% dei casi entro 16 settimana. Un gruppo di controllo di 48 persone senza la malattia di Lyme è stato utilizzato nello studio, confrontandoli con un primo gruppo di 50 Pazienti con malattia di Lyme e un secondo gruppo di 72 casi confermati. I batteri sono stati identificati mediante immunoistochimica, reazione a catena della polimerasi (PCR), e sequenziamento diretto del DNA.

Attenzione su tali risultati positivi

L'alto tasso di successo di questo romanzo prova è stata accolta con entusiasmo da molti malattia di Lyme rappresentanti dei pazienti, ma gli scienziati che lavorano nel campo delle malattie infettive consiglia cautela come metodo era nuovo e non confermata. Tale cautela appare saggia, a posteriori, come l'ultima valutazione del metodo suggerisce che l'alto tasso di sieropositività trovato potrebbe essere stato a causa di contaminazione da laboratorio.

DNA Matching di batteri malattia di Lyme

Durante il test per la malattia di Lyme con il sequenziamento del DNA è comune vedere una varietà di firme genetiche come Borrelia riproducono e mutano molto rapidamente. Omogeneità tra i risultati di tali test è improbabile, salvo i casi di test sono state deliberatamente infettati in un ambiente controllato utilizzando un'unica fonte di batteri. Quello che i ricercatori del CDC trovati ad analizzare questi risultati dallo studio di Sapi era che intorno 80% sequenze di campioni dei pazienti erano indistinguibili da quelli utilizzati nello sviluppo del test. Basta 10 della 51 sequenze pyrG identificati erano diverse a ceppi batterici degli investigatori e gli scienziati del CDC di notare che, mentre non sono sicuri in merito alla rilevanza di questi ceppi, validazione di qualsiasi nuovo metodo di prova è essenziale per prevenire il trattamento antibiotico non necessario a seguito di un falso positivo per la malattia di Lyme.

Nuovo test Finds Malattia di Lyme ceppi batterici non presenti negli Stati Uniti

Barbara J.B. Johnson, Dottorato di Ricerca, dalla Divisione di Malattie trasmesse da vettori in Fort Collins, Colorado, e colleghi del CDC sono stati particolarmente interessati a lavorare fuori perché il sequenziamento del DNA utilizzato in questo studio sembra dimostrare che la maggior parte dei pazienti sono stati infettati con ceppi di batteri della malattia di Lyme, che non erano stati precedentemente individuati in pazienti statunitensi o canadesi. Questi ceppi, Borrelia afzelii e Borrelia garinii, sono più comunemente si trovano in Europa e in Asia, ma non sono noti per essere presenti in Nord America.


Come il test è stato ideato

I ricercatori che sviluppano il test usati due malattia di Lyme ceppi batterici comunemente impiegati nei test di laboratorio per la malattia negli Stati Uniti, B31 e 297, a fianco i due ceppi eurasiatica. Questi ceppi, quando si trovano in pazienti US, si assumono essere il risultato di esposizione a zecche quando si viaggia fuori degli Stati Uniti, senza rilevamento confermato di questi batteri nelle zecche testati sul suolo americano.

Contaminazione batterica e Falsi Positivi

Come tale, gli scienziati CDC cominciato a chiedersi se l'elevato grado di omogeneità tra campioni di prova e la presenza di ceppi batterici improbabili non era un risultato di esposizione e di infezione, ma di contaminazione accidentale in laboratorio dal protocollo di test stessi. Anche i diversi ceppi di questi batteri sarebbero, se l'infezione si era creata naturalmente, risultato in diverse sequenze di DNA tra i campioni dei pazienti e così gli scienziati hanno confrontato le sequenze pyrG per 51 isolati di pazienti che utilizzano gli stessi primer come quelli utilizzati da Sapi, et al.

Partite quasi esatta per i riferimenti Ceppi

Che cosa hanno trovato è stato il più della metà (53%) dei campioni dei pazienti sono stati infettati con B. garinii, con 20 Di quelli 27 trovato essere cloni identici al ceppo utilizzato come riferimento nello sviluppo della prova. Differenze negli altri campioni sono stati limitati a un singolo nucleotide mutato in cinque casi, due differenze in un caso, e tre differenze nel caso rimanente. Questi tipi di somiglianze sono altamente indicativi di qualcosa di diverso dal naturale dell'infezione.

Minore di 10% dei campioni non altamente sospetta

Inoltre, 41% della 51 pazienti avevano B. sequenze burgdorferi-correlate e tutti, ma uno di loro aveva corrispondenze esatte al ceppo di riferimento. Campioni di due pazienti contenevano ceppi di B. afzelii strettamente legato al campione di riferimento, il che significa che 80% (41/51) dei campioni dei pazienti erano identici ai ceppi di test, con un'altra 12% differenziano di un singolo nucleotide. Che lascia solo 4 pazienti i cui test non erano una corrispondenza esatta o una corrispondenza quasi identico a dei ceppi batterici utilizzati in questo romanzo, e prova apparentemente di grande successo.

Ulteriore validazione Needed

Piuttosto caritatevolmente, i ricercatori del CDC di notare che "è necessaria una ulteriore validazione del metodo di coltura romanzo proposto,” nonostante quello che sembra essere una bella chiara indicazione di qualcosa essendo andato male con il protocollo di sperimentazione che porta alla contaminazione con i ceppi di riferimento. La contaminazione sospetta potrebbe essere dovuto all'uso di metodi PCR che sono stati impiegati pur avendo poco merito quando la coltura contiene abbastanza batteri per essere visto sotto un microscopio. Poiché i campioni di controllo non sono stati testati utilizzando la PCR può essere che queste evitati la contaminazione, conseguente sieronegatività. Se fossero stati tutti testati con PCR può essere che Sapi, et al, avrebbe trovato un tasso sorprendentemente alto di positività per la malattia di Lyme tra coloro senza altra indicazione della malattia. Questo, stessa, avrebbe (fiduciosamente) lanciato l'allerta circa i protocolli di prova.

Esercitare cauto ottimismo sopra New Lyme Protocolli di test per le malattie

Senza effettuare lo studio di nuovo, eliminando la fase di test PCR, è impossibile dire se è stato questo che ha causato la contaminazione sospetta e, infatti, se il nuovo test potrebbe essere utile nel individuare la malattia di Lyme. Che l'esperienza ci dice è che un singolo studio che presenta risultati che sembrano troppo belle per essere vere dovrebbe portare a un cauto ottimismo e di sano scetticismo, piuttosto che aumentare le speranze pronto per essere tratteggiata.

Riferimenti

Barbara J.B. Johnson #, Mark A. Pilgard e Theresa M. Russell, Valutazione del nuovo metodo di Cultura a specie DetectBorrelia nel siero di pazienti con malattia di Lyme, J Clin Microbiol. Pubblicato online agosto 14, 2013.

Sapi E, Pabbati N, Incontri, Davies EM, Rattelle A, Kuo BA. Miglioramento delle condizioni di coltura per la crescita e la rilevazione di Borrelia dal siero umano. Int J Med Sci 2013; 10(4):362-376. Disponibile da http://www.medsci.org/v10p0362.htm


{ 2 commenti… aggiungere un }
  • Tom Agosto 29, 2013, 1:00 alla

    Il CDC ha inserito le loro sequenze pyrG nel NCBI GenBank

    Borrelia burgdorferi 297 CTP sintetasi (pyrG) gene, cds parziali, GenBank: KF170281.1, 707 bp
    http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KF170281.1

    Borrelia garinii ceppo Fuji P1 CTP sintetasi (pyrG) gene, cds parziali, GenBank: KF170282.1, 645 bp
    http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KF170282.1

    Borrelia afzelii ceppo BO23 CTP sintetasi (pyrG) gene, cds parziali, GenBank: KF170280.1, 687 bp
    http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KF170280.1

    Ho usato il DNA strumento di confronto sequenza Virginia.edu di fare un 1:1 confronto di ciascuna delle sequenze CDC contro ciascuna delle sequenze ALS come nella tabella carta CDC:

    “Tavolo: Confronto di paziente-associati sequenze geniche pyrG con quelle di ceppi di laboratorio di B. burgdorferi sensu lato.”

    Strumento Virginia.edu -> http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_w … = rm confrontano

    Lo strumento di confronto sequenza Virginia.edu permette di inserire sequenze con numeri di accesso dal database NCBI. Si dà una percentuale di corrispondenza di sequenze allineate e spettacoli differenze,

    Le percentuali di carta da tavolo CDC sono corrette per le sequenze garinii e azfeli.

    Le percentuali carta tabella CDC sono in errore di un carattere per le sequenze burgdorferi perché c'è un errore nella sequenza CDC per KF170281.1 a sua posizione di carattere 618 = “y”. “Y” non è una base valida. Questa è la posizione 546 nella 603 sequenza di lettere per la SLA Bb JX867374.1 in cui si tratta di un “C”.

    A parte l'errore di CDC nella loro sequenza, le percentuali sono corrette se si ignora questa posizione lettera. La carta CDC deve essere corretta. Sono una 100% corrispondere a 602/602, non 603/603. Questo dimostra sciatteria da parte della CDC, ma non è molto rilevante.

    Ho controllato il garinii isola per vedere se uno degli errori indicati nella tabella CDC sono stati nella stessa posizione. Ogni errore negli isolati garinii apparso casuale. Tutti apparsi in posizioni casuali e lettere. Mi chiedevo se raggruppati o erano casuali. Casuale suggerisce possibili errori di sequenziamento, mentre i cluster potrebbero implicare una sequenza unica che varia semplicemente da una lettera.

    Quindi non vi è una corrispondenza inquietante e vicino partite tra gli isolati di SLA e la ATCC disponibile B. burgdorferi sensu stricto ceppo 297 (ATCC 53899), B. afzelii ceppo BO23 (11) (ATCC76 51992), e B. garinii ceppo Fuji P1 (11) (ATCC 51991).

    Dal garinii non è stato trovato in pazienti statunitensi né zecche, tranne gli uccelli marini, la sua preoccupante che 27 degli isolati SLA erano garinii. Questo implica sia Borrelia garinii è stato perso negli Stati Uniti per più di 25 anni di ricerca o di queste persone sono state infettate fuori degli Stati Uniti, dove si trova garinii.

    È ancora più preoccupante che 20 di questi hanno la stessa 603 lettera parziale pyrG e l'altra 7 sono abbastanza vicini e apparire come errori di sequenziamento casuale.

    È inoltre preoccupante che il ceppo ATCC acquisito garinii Fuji P1 (ATCC 51991) ha anche lo stesso parziale sequenza genica pyrG.

    Va notato che la garinii fare anche corrispondono 2 ceppi garinii esistenti dal Giappone e dalla Russia. Non è l'Europa.

    Borrelia garinii ceppo Ekb704-11 CTP sintetasi (pyrG) gene, cds parziali, GenBank: JX971327.1 Russia
    http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/JX971327

    Borrelia garinii pyrG gene per la CTP sintetasi, cds parziali, isolare: HP1, GenBank: AB555778.1 Giappone
    http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AB555778.1

    Credo che la SLA ha bisogno di spiegare perché un ceppo eurasiatico garinii è stato trovato nel loro studio e il motivo per cui tutti così strettamente corrispondono e perché anche corrispondere al meglio alla prova ATCC acquisito garinii ceppo Fuji P1 (ATCC 51991).

    Credo che questo sarà difficile da spiegare a meno che queste persone hanno viaggiato per tutta l'Eurasia. Anche allora sarà necessario seguire gli studi per convalidare veramente la cultura.

    I risultati della Borrelia burgdorferi non sono tagliata il più chiaro. Ci sono un certo numero di ceppi statunitensi che corrispondono gli isolati. La partita per il ceppo di prova è un peccato.

    Il risultato azfelii non è anche preoccupante. Qualcuno in studio potrebbe aver notato questo al di fuori degli Stati Uniti. La partita per il ceppo di prova è un peccato.

    Il secondo azfelii sembra strano. Il azfelii vicina nel database NCBI è un 584/603 fiammifero. Questo è abbastanza distante e suggerisce la sequenza può provenire da un errore di DNA misto. Il suo chiaro al meglio. Sembrerebbe strano che nessun database ceppo NCBI azfelii esistente è stato anche vicino.

    Mi dispiace e non felice di segnalare questo come sono stato un sostenitore della cultura SLA e sperava che sarebbe stato indicato per essere valida. Io non sono pro-IDSA o CDC. Ho coltivato 3 volte positivi. Io preferirei imparare la cultura è valido e conferma la mia sierologia positiva e sarebbe utile per confermare il successo del trattamento e la fine della mia infezione. Questo è il motivo per cui le culture sono il gold standard. Vorrei anche sapere la verità. Invalidando questo studio la cultura non significa nulla se non solo che. Speriamo che gli studi di follow up mostrano la cultura è un bene.

  • Mary Louis Settembre 4, 2013, 4:58 pm

    CDC si sono resi colpevoli di false accuse.
    Nessuna contaminazione potrebbe essere avvenuta, come si sono svolti i ceppi di laboratorio 200 miglia dal laboratorio in cui i pazienti’ sangue è stato coltivato.

    CDC inoltre pubblicato re sequenze di DNA che hanno annunciato di aver depositato in GenBank – questi non erano lì. Ora sono stati depositati (molto tardiva) ed esistono discrepanze con quello che riferiscono.

    B. garinii è in Messico e quindi logicamente sarebbe in US troppo.

    Incredibilmente, Dr McSweegan di NIH pretneded di essere un paziente per anni, per ingannare la gente a credere il test non è valido. Ha confessato il LYmeNet che “LHCTom” aka Tom Eames era davvero lui. McSweegan è stato licenziato dal suo incarico di Lyme Program Officer presso NIH anni fa per molestie attivisti dei pazienti.

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